簡要描述：僅需將Phos-tag® Acrylamide與丙烯酰胺溶液混合并聚合，即可生成用于分離磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)的Phos-tag® SDS-PAGE。在不使用放射性同位素的情況下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于 Western blotting 和質(zhì)譜分析等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
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用于通過 SDS-PAGE 分離磷酸化蛋白質(zhì)
Phos-tag® Acrylamide
僅需將Phos-tag® Acrylamide與丙烯酰胺溶液混合并聚合，即可生成用于分離磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)的Phos-tag® SDS-PAGE。
在不使用放射性同位素的情況下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于 Western blotting 和質(zhì)譜分析等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Phos-tag™ SDS-PAGE 操作簡單，只需在常規(guī) SDS-PAGE 膠中加入 Phos-tag™ Acrylamide 和 Mn2+ 或者 Zn2+ 即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在電泳過程中，磷酸化蛋白的磷酸基團(tuán)與 Phos-tag™ 中的二價(jià)金屬離子相結(jié)合，降低其遷移速度，從而可區(qū)分磷酸化與非磷酸化蛋白。
◆優(yōu)點(diǎn)、特色
● 采用 Phos-tag™ SDS-PAGE 可輕松分離磷酸化蛋白
無任何放射性元素及化學(xué)標(biāo)記！
● 不論氨基酸殘基的類型/位點(diǎn)如何，均可使用
可用于未知的磷酸化分析
可用于檢測新的磷酸化位點(diǎn)（無需購買商品化磷酸化抗體、無需特意制備磷酸化抗體）
● 磷酸化位點(diǎn)數(shù)量/位點(diǎn)不同的磷酸形式也可分離
顯示磷酸化程度和磷酸化形式
● 可同時(shí)檢測磷酸化/非磷酸化形式
可定量各種磷酸化形式
可簡單明確有無磷酸化
● 無需RI或特殊的儀器
實(shí)驗(yàn)成本低，操作簡單。（SDS-PAGE的試劑→只要有設(shè)備即可使用）
● 電泳后可用于WB、MS分析，也可用于二維電泳
WB：可分析內(nèi)源性蛋白
MS：可顯示各磷酸化形式的磷酸化位點(diǎn)的組合
二維電泳：可分離相同等電點(diǎn)和分子量的磷酸化形式
適用于內(nèi)源性蛋白的磷酸化分析！
◆Phos-tag® SDS-PAGE的原理
Phos-tag® Acrylamide的結(jié)構(gòu)
1. 電泳中的磷酸化蛋白會(huì)被2個(gè)二價(jià)金屬離子捕獲
2. 磷酸化水平越高，電泳速度越慢
3. 根據(jù)磷酸化水平進(jìn)行分離（即使磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量相同，只要位置不同也可進(jìn)行分離）
常規(guī)的SDS-PAGE（上圖：非Phos-tag® 條件下）中，無法確認(rèn)底物是否被磷酸化。
◆案例、應(yīng)用
【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】
“我推薦使用Phos-tag ™ ——東京大學(xué)研究院醫(yī)學(xué)研究科 小川覺之"
Phos-tag ™ 是專為研究磷酸化蛋白而新開發(fā)出來的試劑。此產(chǎn)品使用方便，不但可用于體外實(shí)驗(yàn)，還能定量分析體內(nèi)蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常規(guī)電泳實(shí)驗(yàn)，無需購買特殊設(shè)備，性價(jià)比高。傳統(tǒng)蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體、RI 等其它試劑，操作復(fù)雜，花費(fèi)大，且放射性元素會(huì)有安全隱患，而 Phos-tag ™ 的出現(xiàn)恰恰可以彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)，為磷酸化蛋白研究提供新的方向。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分離效果圖
Lane 1 為非磷酸化蛋白，Lane 2-5 為磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化狀態(tài)不同而條帶遷移率也有所不同。
磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數(shù)量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的豐度等都可根據(jù)條帶遷移和條帶濃度求得。
【資料提供】
日本東京大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)系研究科
【二維電泳中的應(yīng)用：分析 hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體】
小鼠巨噬細(xì)胞 J774.1 經(jīng) LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K 。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點(diǎn)代表不同的亞型或修飾蛋白。
二維電泳
同一個(gè)等電點(diǎn)的位置上，不同位點(diǎn)發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【參考文獻(xiàn)】
Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.
【結(jié)果提供】
橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化學(xué)研究所 RCAI 小原收
【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】
常規(guī) SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實(shí)驗(yàn)分析 EGF 刺激的 A431 細(xì)胞中 MAPK 磷酸化水平。
摘自 Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.
【使用示例：α-酪蛋白去磷酸化反應(yīng)隨時(shí)間的變化】
使用Phos-tag® SDS-PAGE和常規(guī)SDS-PAGE分離堿性磷酸酶隨時(shí)間（孵育時(shí)間：0~120 min）去磷酸化的α-酪蛋白樣品。
◆相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱 | 用 途 |
Phos-tag™ Acrylamide | 分離: SDS - PAGE 分離不同磷酸化水平的蛋白 |
SuperSep Phos-tag™ | 分離: 預(yù)制膠中含有50μM Phos-tag™ Acrylamide |
Phos-tag™ Biotin | 檢測: 代替 Western Blot 檢測中的磷酸化抗體 |
Phos-tag™ Agarose | 純化: 通用柱層析，純化磷酸化蛋白 |
Phos-tag™ Mass Analytical Kit | 分析: 用于質(zhì)譜 MALDI-TOF/MS 分析，提高磷酸化分子的檢測靈敏度 |
phos-tag™ 由日本廣島大學(xué)研究生院醫(yī)齒藥學(xué)綜合研究科醫(yī)藥分子功能科學(xué)研究室開發(fā)，對(duì)應(yīng)指導(dǎo)手冊(cè)請(qǐng)見相關(guān)資料。
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 304-93526 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液 | 0.3 mL | 蛋白研究 | 溶液型 |
| 300-93523 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 Phos-tag 丙烯酰胺 | 2 mg | 蛋白研究 | 粉末型 |
| 304-93521 | Phos-tag Acrylamide AAL-107 Phos-tag 丙烯酰胺 | 10 mg | 蛋白研究 | 粉末型 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級(jí) | 備注 |
| 301-93531 | Phos-tag™ Biotin BTL-104 Phos-tag™ 生物su | 10 mg | - | - |
| 308-97201 | Phos-tag Biotin BTL-111 1mM Aqueous Solution Phos-tag™ 生物su素1mM水溶液 | 0.1 mL | - | - |
| 387-07321 | Phos-tag™ Tip Phos-tag™ 瓊脂糖槍頭 | 8 pcs | - | - |
| 192-17401 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 6%, 13 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，6%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 199-17391 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 6%, 17 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，6%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 193-16691 | SuperSepTM Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 13 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，15%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 193-16711 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 13 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，10%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 196-16701 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 15%, 17 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，15%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 190-16721 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 10%, 17 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，10%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 195-17371 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 7.5%, 13 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，7.5%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 192-17381 | SuperSep™ Phos-tag™ (50 μmol/L), 7.5%, 17 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L，7.5%，17孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 193-16571 | SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 17 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/ L，12.5%，17孔（用于Wako EasySeparator電泳儀） | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 195-16391 | SuperSep™ Phos-tag™ (50μmol/L), 12.5%, 13 well Phos-tag™ 預(yù)制膠50μmol/L ，12.5%，13孔 | 5 塊 | 電泳用 | - |
| 305-93551 | Phos-tag™ Mass Analytical Kit Phos-tag™ 質(zhì)譜分析試劑盒 | 1 Set | 電泳用 | - |
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