熒光標記 rBC2LCN（AiLecS1）

未分化人ES/iPS細胞檢測試劑

僅需添加培養液便可檢出人ES/iPS細胞！

熒光標記 rBC2LCN（AiLecS1）

◆rBC2LCN（AiLecS1）

　　rBC2LCN（AiLecS1）是在伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）來源凝集素 BC2L-C 的 N末端域表達的重組凝集素。

　　由于 rBC2LCN 對存在于人ES/iPS細胞表面的足糖萼蛋白（Podocalyxin）上的粘蛋白樣O-型糖鏈的H型3（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高親和力，因此可用作人 ES/iPS 細胞的未分化標志物。

　　本產品是熒光染色標記，能直接添加到人 ES/iPS 細胞的培養液中，實現未分化活細胞分析。 適用于未分化細胞檢測用標記?？捎糜诩毎旧魇郊毎麅x。另外，使用本品持續培養數日已確認細胞無毒性。

　　我們供應綠色熒光標記（FITC），黃色熒光標記（Cy3），紅色熒光標記（Cy5）的三種類型的系列商品。

◆特點

●　添加到培養基即可進行染色

●　無需固定細胞，活細胞也可直接進行明顯染色

●　細胞毒性低，染色后也可培養

●　識別 Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3, SSEA-4 細胞表面存在的糖鏈

●　可用于細胞染色和流式細胞儀

◆產品概述

●　已進行無菌試驗（0.1 μm 過濾器進行滅菌）

●　PBS(-) 溶液

●　使用時稀釋比

　  Live Cell Imaging 1：100～1,000
　  Flow Cytometry 1：100～1,000

●　激發波長/發射波長

◆使用方法

細胞染色

活細胞染色（Live Cell Imaging）

1. 準備培養中的人 ES/iPS 細胞

2. 每 1 mL 的培養基添加 1~10 μL 的熒光標記 rBC2LCN

3. 37℃，5％CO₂ 孵育 30 分鐘。

4. 更換新的培養基或者 HBSS(+)。

5. 利用熒光顯微鏡觀察

固定細胞染色

1. 準備培養中的人 ES/iPS 細胞

2. 除去培養基，用 HBSS(+) 洗凈。

3. 添加 4%多聚甲醛（PFA）溶液，室溫靜置 10～20 分鐘。

4. 除去 PFA 后，用 D-PBS(-) 洗凈三次。

5. 添加 D-PBS(-)。

6. 每 1 mL 的 D-PBS(-) 添加 1～10 μL 熒光標記 rBC2LCN。

7. 37℃，5% CO₂ 孵育 30 分鐘。

8. 更換 D-PBS(-)。

9. 利用熒光顯微鏡觀察。

流式細胞儀

1. 準備培養中的人 ES/iPS 細胞。

2. 使用細胞分散液，分散成單細胞。

3. 將細胞分散液移至管內，1,000 rpm 離心 3 分鐘。

4. 除去上清液，用 FCM Buffer* 重懸細胞，離心后，舍棄上清液。

* FCM Buffer： D-PBS(-)和HBSS(-)含有 10 mmol/L EDTA，1% BSA

5. 用 FCM Buffer 重懸出 5×10⁶ cells/mL 的細胞懸浮液

6. 每 1 mL 細胞懸浮液，添加 1～10 μL 的熒光標記 rBC2LCN。

7. 室溫，避光靜置30分鐘。

8. 1,000 rpm 離心三分鐘，除去上清液。

9. 用 FCM Buffer 重懸細胞，離心后，除去上清液。

10.  適量的 FCM Buffer 再懸浮細胞。

11.  進行流式細胞術。

使用注意

1. rBC2LCN 染色可以維持 2~3天。

2. 使用含有血清的培養基可能使信號背景變高

3. 根據流式細胞儀進行細胞分選時，當細胞分散或 FCM 緩沖液的終濃度到達 10 μmol/L 時，請添加 Y-27632。

◆人iPS細胞的活細胞染色（Live Cell Imaging）

●　用 rBC2LCN-FITC， rBC2LCN-635 以及 Hoechst33342 對人 iPS 細胞 201B7 株進行染色處理。（無細胞固定）

（稀釋倍數　1：1,000）

●　用 rBC2LCN-FITC、Tra-1-60、Tra-1-81、SSEA-4 對人 iPS 細胞 201B7 株進行染色處理。

　  2小時后確認染色圖像。（未固定細胞）

（稀釋倍數　1：100）       

★　與 Tra-1-60、Tra-1-81 相比較，rBC2LCN 的活細胞染色度更強。

★　即使交換培養基，rBC2LCN 染色第二天后染色效果依然明顯。

◆人ES細胞的活細胞染色（Live Cell Imaging）

　　使用 rBC2LCN-FITC 對人 ES 細胞 WA01 株進行染色（未細胞固定）。細胞的一部分無法維持未分化狀態而進行分化。如果使用 rBC2LCN-FITC 對活細胞進行染色，以維持未分化狀態部分已染色，而已分化部分未染色來進行區分。

＜數據提供 國家研究與發展公司優良工業科學和技術研究院 新藥開發的基礎研究部門恭子小沼老師，伊藤弦老師＞

◆人 iPS 細胞固定后染色

　　將人 iPS 細胞 201B7 株用多聚甲醛固定后，使用 rBC2LCN 和 DAPI 進行細胞染色。

對于人 iPS 細胞毒性評估

　　向人 iPS 細胞 201B7 株的培養液中分別添加其 1/1,000、1/100、1/50 量的 rBC2LCN-FITC，持續培養。其結果是，不存在 rBC2LCN-FITC 濃度對毒性影響，不同濃度的細胞增殖程度相同程度。

〔細胞株〕
　人iPS細胞 201B7株

〔培養基組成〕
　StemSure^® hPSC培養基Δ+35 ng/mL bFGF

〔涂層〕
　Matrigel^® hESC-Qualified Matrix

〔細胞接種數目〕
　4×10⁴ cells/well（12孔板）

　使用Flow Cytometry進行人iPS細胞分離

　使用rBC2LCN-FITC及rBC2LCN-6547、rBC2LCN-635對人iPS細胞201B7細胞株和人正常二倍體成纖維細胞染色，進行流式細胞術。

　實驗結果：未分化的人iPS細胞與分化的人二倍體成纖維細胞成功分離。

◆產品列表