高靈敏度脂滴長(zhǎng)時(shí)間成像熒光染料

LipiDye II 是一款可用于長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像的高靈敏度優(yōu)質(zhì)脂滴染料試劑。此外，它還具有脂滴特異性高、毒性低和光穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。適用于以天數(shù)為單位的長(zhǎng)時(shí)間觀察、脂滴融合和分解過程的活細(xì)胞成像以及使用超高分辨率顯微鏡的超微小脂滴可視化。

※ 本產(chǎn)品基于名古屋大學(xué) 變革生命分子研究所 山口茂弘教授、多喜正泰特任準(zhǔn)教授的研究結(jié)果，由funakoshi株式會(huì)社進(jìn)行商品化并銷售。

※ 本產(chǎn)品僅供研究用，請(qǐng)勿用于研究以外用途。

使用LipiDye II染色脂肪細(xì)胞和非脂肪細(xì)胞的案例

◆關(guān)于脂滴（Lipid droplet）和LipiDye

脂滴（Lipid droplet）是在脂肪細(xì)胞（Adipocyte）中發(fā)現(xiàn)的大型中性脂肪的結(jié)塊，主要成分是甘油三酯（Triglyceride）和甾醇酯（Sterol Ester）的單分子層結(jié)構(gòu)體（圖1）。脂滴被認(rèn)為是儲(chǔ)存細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的細(xì)胞器，并且有較多肥胖和疾病相關(guān)的報(bào)道。最近，除了脂肪細(xì)胞，還在肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等各種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了脂滴。這些發(fā)現(xiàn)明確了其不僅僅是作為中性脂質(zhì)的儲(chǔ)存場(chǎng)所，還有抑制代謝和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等各種功能。對(duì)各種細(xì)胞中的脂滴進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，非脂肪細(xì)胞的脂滴在1 μm以下，與脂肪細(xì)胞中的10~100 μm的脂滴相比較小（圖2）。因此，可以利用成像來檢測(cè)活細(xì)胞中非脂肪細(xì)胞的微小脂滴的試劑備受期待，但目前Nile Red等現(xiàn)有試劑會(huì)觀察到脂滴以外的染色試劑（信噪比低），不適用于活細(xì)胞成像，觀察微小脂滴僅限于電子顯微鏡觀察。

而LipiDye 是一款可以顯示高S/N比率的脂滴染色試劑，雖然檢測(cè)1 μm以下的小脂滴的效果優(yōu)異，但從光穩(wěn)定性的觀點(diǎn)來看，長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像的效果不佳。而LipiDye II 是名古屋大學(xué) 變革生命分子研究所（ITbM）的山口教授、多喜特任準(zhǔn)教授為了解決上述問題而研發(fā)的新型脂滴檢測(cè)試劑（參考文獻(xiàn)中的名稱為L(zhǎng)AQ1），光穩(wěn)定性非常高，毒性低，適合用于長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的活細(xì)胞成像。

圖1：脂滴的模式圖及脂肪細(xì)胞（adipocyte）中可見的大型脂滴

圖2：不同細(xì)胞類型中脂滴的成像圖例

◆特點(diǎn)

●　不僅可以選擇性濃縮脂滴，還會(huì)響應(yīng)疏水性環(huán)境而發(fā)出熒光，因此可以抑制細(xì)胞質(zhì)等的部分發(fā)光，對(duì)脂滴有著高信噪比（S/N比）

●　可檢測(cè)非脂肪細(xì)胞中的小型脂滴（小于1 μm）

●　光穩(wěn)定性高，長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像效果優(yōu)異

●　由于不會(huì)褪色，可用于脂滴分解過程中的熒光觀察

●　在推薦的使用濃度（0.1~1 μM）中幾乎不顯示細(xì)胞毒性。在已添加試劑的狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞分化過程的觀察記錄最長(zhǎng)達(dá)8天

●　活細(xì)胞、固定細(xì)胞都可使用。也適用于活細(xì)胞染色后再固定處理的情況

●　也適用于STED超高分辨率顯微鏡。可觀察到約200 nm（半峰全寬）的脂滴

◆關(guān)于熒光波長(zhǎng)（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)）

激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：400~500 nm/490~600 nm

※ 雖然最大吸收為410~420 nm，但也可用450~500 nm范圍的光源激發(fā)。詳情請(qǐng)參考下方的激發(fā)/發(fā)射光譜數(shù)據(jù)。

※ 可用800 nm激光進(jìn)行雙光子激發(fā)。詳情請(qǐng)參考下方利用雙光子顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞。

※ 可進(jìn)行多重染色，但需要注意波長(zhǎng)的選擇。請(qǐng)使用激發(fā)光在500 nm以上的染料。若使用在450 nm以下的范圍內(nèi)激發(fā)的普通藍(lán)色熒光染料，可能

※ 會(huì)同時(shí)激發(fā)本試劑。

■　光源示例

◆LipiDye與其他試劑相比的優(yōu)點(diǎn)

◆參考文獻(xiàn)

"Fused Thiophene-S,S-dioxide-Based Super-Photostable Fluorescent Marker for Lipid Droplets."

Taki, M., et al., ACS Mater. Lett., 3(1), 42～49 (2021)

◆參考數(shù)據(jù)

激發(fā)/發(fā)射光譜

LipiDye II是溶劑環(huán)境響應(yīng)型熒光染料（Solvatochromic dye），會(huì)根據(jù)周圍的分子極性改變熒光波長(zhǎng)。吸收光譜幾乎不受溶劑的影響，可觀察到在380~500 nm的吸收（圖A）。

● 推薦激發(fā)光：405 nm、445 nm、458 nm、473 nm激光

● 可使用的激發(fā)光：488 nm激光（由于熒光強(qiáng)度弱，建議根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)使用濃度等進(jìn)行驗(yàn)證。）

另外，熒光光譜依賴于溶劑極性，在甲苯和二氯甲烷等疏水性環(huán)境下會(huì)顯示強(qiáng)烈的藍(lán)~綠色熒光，但在乙腈、DMSO和水溶液等高極性環(huán)境下，極性越大，最大熒光就會(huì)轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)波長(zhǎng)一側(cè)，對(duì)熒光強(qiáng)度的抑制就越明顯（圖B）。根據(jù)這個(gè)特性，可觀察到脂滴在疏水性環(huán)境下的特異性綠色熒光。

用LipiDye II對(duì)細(xì)胞染色，用顯微鏡光譜掃描脂滴部分，評(píng)估脂滴的熒光，約在500 nm附近可觀察到最大的熒光光譜（圖C）。

※ 圖A~圖C的灰色陰影區(qū)域?yàn)橥扑]激發(fā)/熒光波長(zhǎng)。

光穩(wěn)定性

用4%多聚甲醛固定處理3T3-L1脂肪細(xì)胞，再分別用新產(chǎn)品LipiDye II、舊款產(chǎn)品LipiDye 和傳統(tǒng)的熒光染料B染色，之后使用共聚焦激光顯微鏡反復(fù)進(jìn)行Z-stack成像（激發(fā)473 nm/熒光：490~540 nm），觀察熒光強(qiáng)度的變化。在Z-stack成像中，每拍攝一次可獲取10張2 μm的圖像。傳統(tǒng)染料B經(jīng)過約5次的Z-stack成像后衰減明顯，而相比之下，舊款產(chǎn)品LipiDye雖然有耐光性，但也觀察到了緩慢的衰減，在經(jīng)過50次的Z-stack成像后熒光衰減至60％左右。

而在本試劑LipiDye II中，即使經(jīng)過50次（共計(jì)500次的光照射），其熒光強(qiáng)度也幾乎不發(fā)生變化。顯示了LipiDye II具有非常高的光穩(wěn)定性，適用于長(zhǎng)時(shí)間的延時(shí)成像（包括Z-stack成像）。

細(xì)胞毒性

使用不同濃度的LipiDye II 處理 3T3-L1脂肪細(xì)胞，然后使用MTT Assay評(píng)估24 h后的細(xì)胞活性。本試劑的推薦使用濃度為0.1~1 μM，但至少在5 μM內(nèi)未觀察到細(xì)胞毒性。在10 μM以上才觀察到細(xì)胞毒性。

活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色

用LipiDye II對(duì)活細(xì)胞狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細(xì)胞染色，然后在活細(xì)胞中進(jìn)行熒光觀察（左圖）。之后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，清洗后在固定狀態(tài)下再次進(jìn)行熒光觀察（右圖）。固定前后幾乎未觀察到熒光信號(hào)的變化。表明了本試劑除了可用于活細(xì)胞染色，也可兼容固定細(xì)胞的免疫染色。

LipiDye^®染色的活細(xì)胞和經(jīng)PFA固定后的熒光強(qiáng)度的對(duì)比

◆應(yīng)用數(shù)據(jù)

在各種細(xì)胞中的染色

用LipiDye II（1 μm）分別染色3T3-L1、HepG2、COS-7、HeLa細(xì)胞，在共聚焦激光顯微鏡下觀察綠色熒光（激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm）（比例尺：20 μm）。在HepG2中，為使脂滴形成，用脂肪酸處理了1天。在HeLa細(xì)胞中可清晰地觀察到1 μm以下的小脂滴（參考Hela細(xì)胞放大圖像（右側(cè)），比例尺：5 μm）。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）標(biāo)記及其多色成像

用LipiDye II（1 μm）對(duì)表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）駐留紅色熒光蛋白（ER-mKO1）的COS-7細(xì)胞進(jìn)行染色，使用共聚焦激光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察（LipiDye II：激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm，ER-mKO1：激發(fā)559 nm/熒光570~620 nm）。可以觀察到COS-7細(xì)胞內(nèi)部的小脂滴（＜1 μm），并且大部分駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè)（參考右側(cè)的放大圖，比例尺：1 μm）。該結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在脂滴的生物合成。

長(zhǎng)時(shí)間觀察脂肪細(xì)胞的分化過程

用LipiDye II在共聚焦激光顯微鏡下觀察活細(xì)胞中誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為脂肪細(xì)胞時(shí)，成熟脂滴的狀態(tài)8天（激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm）。前2天在含LipiDye II的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，之后每隔兩天更換至含LipiDye II（1 μm）的維持培養(yǎng)基中，熒光觀察共計(jì)8天。即使用LipiDye II進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的處理，也沒有細(xì)胞毒性和對(duì)脂肪細(xì)胞分化產(chǎn)生影響，可以觀察到脂滴成熟的過程。

活細(xì)胞成像中新生脂滴的動(dòng)態(tài)行為分析

利用長(zhǎng)時(shí)間延時(shí)成像（Z-stack成像），觀察在誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化為脂肪細(xì)胞時(shí)新生脂滴的動(dòng)態(tài)行為約24 h（共聚焦激光顯微鏡：激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm，每10 min拍攝一次，Z-stack 20張/次）。向預(yù)先已經(jīng)用LipiDye II染色的前脂肪細(xì)胞中添加分化培養(yǎng)基（含有LipiDye II），然后立即開始延時(shí)成像。分化誘導(dǎo)后約10 h，開始看到小脂滴的出現(xiàn)（650 min，白色箭頭），可以觀察到各脂滴在相互作用的同時(shí)，不斷成長(zhǎng)的狀態(tài)（950~1450 min，黃色箭頭）。

觀察脂滴分解·新生過程隨著時(shí)間的變化

向分化誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞中添加腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin（10 μM）和磷酸二酯酶抑制劑IBMX（100 nM），觀察在使用了LipiDye II的延時(shí)成像（Z-stack）中脂滴隨著三酰基甘油的分解而縮小的過程（共聚焦激光顯微鏡：激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm，800 min，每4 min拍攝一次，Z-stack 15張/次）。從圖中可以看到原本的大脂滴（請(qǐng)參見白色箭頭）隨著時(shí)間的推移逐漸變小。另外，可以看到隨著時(shí)間的推移又產(chǎn)生了許多小脂滴（黃色三角形）。

結(jié)果表明，LipiDye II具有非常高的光穩(wěn)定性，無需擔(dān)心褪色；并有著高信噪比，可以觀察到微小的新生脂滴，因此可以定量觀察脂滴的增減。

利用STED超高分辨率顯微鏡可視化微小脂滴

用LipiDye II（1 μm）染色Hela細(xì)胞，使用激光共聚焦顯微鏡（Confocal）（激發(fā)473 nm/熒光490~540 nm）和STED超高分辨率顯微鏡（激發(fā)473 nm + STED 660 nm/熒光500~640 nm）對(duì)微小脂滴進(jìn)行觀察。STED觀察圖像顯示的是經(jīng)過反卷積處理的數(shù)據(jù)。從圖中可以發(fā)現(xiàn)在共聚焦激光顯微鏡下較為模糊的微小脂滴，在STED顯微鏡中非常清晰，半峰全寬（FWHM）約為120 nm。

※    關(guān)于STED顯微鏡的觀察條件及分析方法，請(qǐng)見參考文獻(xiàn)。

利用雙光子顯微鏡觀察小膠質(zhì)細(xì)胞

向大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞中添加LipiDye II（1 μm），染色過夜后，用4%PFA固定，然后在雙光子顯微鏡下進(jìn)行觀察。可見LipiDye II使用雙光子激發(fā)法也可以激發(fā)，可以檢測(cè)原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞中尺寸各異的脂滴。

（數(shù)據(jù)提供：Dr. Hyun Beom Choi以及 Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia）

※ 本頁(yè)面產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。